Ultrastrukturelle Studie bestätigt die Bildung einzelner und heterotypischer Synzytialzellen in bronchoalveolären Flüssigkeiten von COVID

Virology Journal Band 20, Artikelnummer: 97 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Es wurde berichtet, dass SARS-CoV-2 Zellfusionen zur Bildung mehrkerniger Synzytien induziert, die die virale Replikation, Verbreitung, Immunumgehung und Entzündungsreaktionen erleichtern könnten. In dieser Studie haben wir mittels Elektronenmikroskopie über die Zelltypen berichtet, die in verschiedenen Stadien der COVID-19-Erkrankung an der Bildung von Synzytien beteiligt sind.

Bronchoalveoläre Flüssigkeiten von mild (n = 8, SpO2 > 95 %, keine Hypoxie, innerhalb von 2–8 Tagen nach der Infektion), mittelschwer (n = 8, SpO2 90 % bis ≤ 93 % bei Raumluft, Atemfrequenz ≥ 24/min , Atemlosigkeit, innerhalb von 9–16 Tagen nach der Infektion) und schwere (n = 8, SpO2 < 90 %, Atemfrequenz > 30/min, externe Sauerstoffunterstützung, nach dem 17. Tag der Infektion) COVID-19-Patienten wurden mittels PAP untersucht ( Identifizierung des Zelltyps), Immunfluoreszenz (für den Grad der Virusinfektion), Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Identifizierung der Synzytien.

Immunfluoreszenzstudien (S-Protein-spezifische Antikörper) an jedem Synzytium weisen auf ein sehr hohes Infektionsniveau hin. Bei leicht infizierten Patienten konnten wir keine Synzytialzellen finden. Allerdings wurde bei mäßig infizierten Patienten unter TEM eine identische (Neutrophile oder Typ-2-Pneumozyten) und heterotypische (Neutrophile-Monozyten) Plasmamembran-Anfangsfusion (was auf den Beginn der Fusion hinweist) beobachtet. Vollständig ausgereifte, große (20–100 μm) Synzytialzellen wurden bei Patienten mit schwerem akutem Atemnotsyndrom (ARDS-like) von Neutrophilen, Monozyten und Makrophagen im SEM gefunden.

Diese ultrastrukturelle Studie an den Synzytialzellen von COVID-19-Patienten gibt Aufschluss über die Krankheitsstadien und die Zelltypen, die an der Synzytienbildung beteiligt sind. Die Bildung von Synzytien wurde zuerst bei Typ-II-Pneumozyten durch homotypische Fusion und später bei hämatopoetischen Zellen (Monozyten und Neutrophilen) durch heterotypische Fusion im moderaten Stadium (9–16 Tage) der Krankheit induziert. Ausgereifte Synzytien wurden in der Spätphase der Erkrankung beobachtet und bildeten große Riesenzellen von 20 bis 100 μm.

Synzytien sind ungewöhnlich große mehrkernige Zellen, die durch die Fusion von zwei oder mehr ähnlichen/verschiedenen Zelltypen unter externen/internen Einflussfaktoren wie Molekülen/Virusinfektionen entstehen [1]. Die Plasmamembran von zwei oder mehr Zellen verschmilzt zu einer einzigen Lipiddoppelschicht, was zur Verschmelzung des Zytoplasmas, nicht aber des Zellkerns führt [2, 3]. Natürlich wurde die Synzytienbildung durch Fusogenproteine vermittelt und in den Muskelfasern, der Plazentaschranke und Knochenosteoklasten beobachtet [3,4,5]. Mechanistisch gesehen wurde es jedoch durch eine virusvermittelte Zellfusion induziert, bei der die Membran umhüllter Viren mit den Plasmamembranen von Zellen verschmilzt. Es wurde berichtet, dass mehrere Erkältungs-Coronaviren wie hCoV-HKU1, hCoV-NL63 und hCoV-229E in Zellkulturmodellen Synzytien bilden, es gibt jedoch keinen Bericht über die Bildung von Synzytien in vivo [6, 7].

Die Bildung von Synzytien wird auch in Zellkulturen und mit SARS-CoV-1, MERS-CoV oder SARS-CoV-2 infizierten Geweben beobachtet [8,9,10,11,12,13,14,15]. SARS-CoV-2-induzierte Synzytien wurden in den Autopsieproben von Lungengewebe bei schwer infizierten COVID-19-Patienten berichtet [1, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20]. SARS-CoV-2 induzierte die Bildung von Synzytien in vitro [21,22,23,24] sowie in vivo [12, 16, 20, 22] mit der Fusion von Pneumozyten und Lymphozyten in der Lunge [12, 20 ].

Über die Generation und Art der Zellen, die in den verschiedenen Stadien der COVID-19-Erkrankung an der Fusion von Synzytialzellen beteiligt sind, wurde nur spärlich berichtet. Dieser Bericht geht auf diese Lücken ein, um das Verständnis der Bildung synzytialer Zellen bei COVID-19-Patienten zu verbessern, indem er mikroskopiebasierte Ansätze auf der Ultrastrukturebene unter Verwendung von PAP (Papanicolaou), IF (Immunfluoreszenz), SEM (Rasterelektronenmikroskopie) und TEM (Transmission) einsetzt Elektronenmikroskopische Bildgebung. Wir haben über das Vorhandensein von Synzytialzellen mit einem oder mehreren Ursprungs in den BALF (bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten) von COVID-19-induzierten ARDS-ähnlichen Patienten (akutes Atemnotsyndrom) berichtet.

Karnovskys Fixiermittel (0,5 % Glutaraldehyd + 2,0 % Paraformaldehyd), Hämatoxylin, Eosin, Orange G., Scotts Wasser, Xylol, DPX, PBS, Poly-L-Lysin, Epoxid-Einbettungskit und DAPI wurden von Sigma Chemical Company, MO, gekauft. USA. BSA, Ethanol stammten von Himedia und Triton X-100 stammte von Fisher Scientific. Osmiumtetroxid wurde von Ted Pella, USA, Uranylacetat von TAAB, Großbritannien, und Bleicitrat von Ladd bezogen. Der polyklonale Anti-SARS-CoV-2-spezifische Primärantikörper (Kat.-Nr. ab275759) und der mit Alexa Fluor-594 konjugierte Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Kat.-Nr. ab150080) wurden von Abcam, Plc, Großbritannien, erworben.

BALF-Proben wurden von intubierten SARS-CoV-2-positiven Patienten auf den COVID-19-Stationen des AIIMS in Neu-Delhi entnommen. Alle Proben wurden zwischen dem 3. Oktober 2020 und dem 31. Januar 2021 gesammelt (Zusatzdatei 1: Ergänzungstabelle 1). Die Patienten wurden auf der Grundlage der Richtlinie des Indian Council of Medical Research (ICMR) [25] in drei Gruppen eingeteilt. Bei dieser Gruppe handelte es sich um (A) Patienten mit leichter Infektion und Nicht-ARDS (Nicht-ARDS, n = 8; SpO2 > 95 %, keine Sauerstoffunterstützung, nur Symptome der oberen Atemwege mit leichtem Fieber und ohne Kurzatmigkeit oder Hypoxie, 2–8 Tage). nach den ersten Symptomen), (B) mittelschwere Infektion (n = 8, Atemfrequenz ≥ 24/min, Atemlosigkeit und SpO2-Wert 90 % bis ≤ 93 % bei Raumluft, externer Sauerstoffunterstützung, 9–16 Tage nach den ersten Symptomen), und (C) Schwerwiegende ARDS-ähnliche Patienten (ARDS-ähnlich, n = 8; Atemfrequenz > 30/min, Atemlosigkeit, SpO2-Wert < 90 % der Raumluft, und ab dem 17. Tag mit externer Sauerstoffunterstützung auf die HDU/Intensivstation eingewiesen )[26, 27]. Die Reaktion des Patienten auf die Infektion und das Ausmaß der COVID-19-Erkrankung variierten in den Tagen nach der Infektion sehr stark. Die maximale Anzahl an Patienten wurde mit leichten krankheitsähnlichen Symptomen innerhalb von 2–8 Tagen, mäßigen krankheitsähnlichen Symptomen innerhalb von 8–16 Tagen und schweren krankheitsähnlichen Symptomen > 17 Tage nach der Infektion erfasst [26, 27]. Daher haben wir die Proben nur von den Patienten gesammelt, die die Krankheitsbedingungen (ICMR-Richtlinie) und die Zeitrahmenkriterien für diese Studie erfüllten (25). Um die COVID-19-Infektion bei allen in die Studie rekrutierten Patienten zu bestätigen (erfasst, aber nicht eingeschlossen), wurde ein RT-PCR-Test durchgeführt.

Die BALF-Probe (15–20 ml) wurde hauptsächlich in frisch zubereiteter 20 ml 2X Karnovsky-Lösung (endgültig 1 % Glutaraldehyd + 4,0 % Formaldehyd) in 0,2 M Phosphatpuffer fixiert und bei 4 °C in einem für COVID-19 vorgesehenen Kühlschrank gelagert. Ein diensthabender Arzt überprüfte und überprüfte alle Krankenakten des Patienten. Patientendaten, Symptome und Anzeichen, RT-PCR-Ergebnisse, radiologische Befunde, Behandlung, unterstützende Pflege und Überlebensdaten wurden aufgezeichnet, aber nicht einbezogen (Zusatzdatei 1: Ergänzungstabelle 1).

Nach der primären Fixierung wurde die BALF-Lösung zehnmal mit 0,1 M NaCl-Lösung verdünnt und durch ein Zellsieb aus Nylonnetz mit einer Pore von 100 μm gesiebt. Das Filtrat wurde 3 Minuten lang bei 2500 U/min in einem Ausschwingeimer zentrifugiert und überschüssiger Schleim durch Waschen der Zellpellets (2–3 Mal für 10 Minuten) mit PBS-Lösung entfernt. Der Zellinhalt wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 1200 g angereichert und erneut im primären Fixiermittel A (0,5 % Glutaraldehyd, 2,0 % Paraformaldehyd in 0,1 M PB-Puffer) resuspendiert. Diese Proben wurden für PAP-Färbung, IF, SEM und TEM verarbeitet.

Für die PAP-Färbung wurden Zytosabstriche unter Verwendung von 200 µl BALF bei 800 U/min für 5 Minuten auf Poly-L-Lysin-beschichteten Glasobjektträgern hergestellt und in 90 % Ethanol konserviert. Die Ausstriche wurden 1 Minute lang in Wasser gewaschen und die Hämatoxylin-Färbung erfolgte 2–4 Minuten lang mit jeweils einminütigem Waschen unter fließendem Leitungswasser, Scott-Wasser und erneut Leitungswasser. Die Abstriche wurden schrittweise jeweils 2 Minuten lang in 70 %, 95 % und 100 % Ethanol dehydriert, 4 Minuten lang mit Orange G behandelt und zunehmend dehydriert. Die Abstriche wurden 10 Minuten lang in Eosin-Färbung getaucht und jeweils 2 Minuten lang mit 95 % Ethanol und Aceton behandelt. Abschließend wurden die gefärbten Ausstriche mit Xylol behandelt (3 Mal, jeweils 5 Minuten) und in DPX montiert.

Für die Immunfluoreszenzstudie wurden BALF-Proben mit 0,1 M Phosphatpuffer (dreimal) gewaschen und Abstriche mit 10 µl Probe auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträgern hergestellt und bei RT luftgetrocknet. Die Abstriche wurden mit PBST (0,1 % Triton Nach der Blockierung wurde es mit dem Primärantikörper (Abcam ab275759, polyklonaler Antikörper gegen S1-Spike-Protein, Verdünnung 1:500) vier Stunden lang in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurde Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Alexa Fluor-594-konjugierter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, Abcam, Kat.-Nr. - 150.080; Verdünnung 1:500;) hinzugefügt und eine Stunde lang bei RT in der Dunkelkammer inkubiert. Die Abstriche wurden mit Phosphatpuffer gewaschen, DAPI (1 µg/ml) zugegeben und 5 Minuten lang inkubiert. Überschüssiges DAPI wurde durch Waschen mit PBS entfernt und die Ausstriche wurden mit 90 % Glycerin aufgetragen. Die Fluoreszenzbildgebung wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Leica SP8, Deutschland) durchgeführt.

Für die SEM wurden angereicherte und primär fixierte Zellkomponenten von BALF mit Ethanol dehydriert und am kritischen Punkt getrocknet (E-3100, Quorum Tech). Die Proben wurden mit doppelseitigem Klebeband auf den Aluminiumstummeln befestigt und mit einem goldbasierten Sputterbeschichter (HHV BT-150) 180 s lang sputterbeschichtet. Elektronenmikroskopische Aufnahmen wurden mit einem EVO18-REM (Zeiss, Deutschland) erstellt, das mit einer Beschleunigungsspannung von 20 kV, einem durchschnittlichen Arbeitsabstand von 8–10 mm mit einem Sekundärelektronendetektor (SE) und Vergrößerungen im Bereich von 5.000- bis 30.000-fach betrieben wurde.

Für die TEM-Bildgebung wurden angereicherte zelluläre Bestandteile von BALF hauptsächlich mit 2,5 % Glutaraldehyd + 2,0 % Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) fixiert. Die Zellpellets wurden mit 0,1 M PB (pH 7,4) gewaschen und mit 1 % Osmiumtetroxid in 0,1 M PB (pH 7,4) eine Stunde lang (sekundäre Fixierung) bei 4 °C nachfixiert. Die Pellets wurden 2 Stunden lang mit destilliertem Wasser gewaschen und durch En-Bloc-Färbung mit 2 % Uranylacetat in 50 % Ethanol angefärbt. Diese Proben wurden erneut mit destilliertem Wasser gewaschen und mit einer Ethanolreihe (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %) dehydriert. Dehydrierte Pellets wurden mit Toluol/Harz infiltriert und in Araldite CY212-Harz eingebettet. Die Blöcke wurden 48 Stunden lang bei 65 °C polymerisiert. Ultradünne Schnitte (~ 70 nm) wurden mit dem Ultramikrotom UC7 (Leica) hergestellt und auf Gitter montiert. Die Schnitte wurden mit 5 % Uranylacetat und 5 % Bleicitrat gefärbt und mit dem Transmissionselektronenmikroskop Talos F200 (Thermo Fisher Scientific) abgebildet.

Mit Zellen angereicherte BALF-Proben von leichten, mittelschweren und schweren ARDS-ähnlichen Patienten (jeweils n = 8) wurden mit Karnovsky-Lösung fixiert und auf PAP (Zytosmear), IF (S-Protein-spezifischer Antikörper für Infektionsgrad) und SEM (Oberfläche) abgebildet Ultrastruktur) und TEM-Bildgebung (Ultrastrukturinformationen). Bei den leicht infizierten Patienten konnten wir keine Synzytien finden (Zusatzdatei 1. Abbildung S1). Allerdings wurden bei mittelschweren und schweren ARDS-ähnlichen Patienten einzelne und unterschiedliche zelluläre Synzytialzellen mit unterschiedlicher Morphologie und Form beobachtet. Wir haben herausgefunden, dass hauptsächlich Typ-II-Pneumozyten, Neutrophile, Monozyten und Makrophagen fusionierten, um die Synzytialzellen im BALF zu bilden. Die Form variiert von rund bis oval und die Größe liegt zwischen 20 und 100 μm.

Wir haben mehrkernige Synzytialzellen identifiziert, die von Typ-II-Pneumozyten bei mäßig infizierten Patienten erzeugt werden. Die PAP-Bildgebung zeigte reaktive zelluläre Veränderungen mit Kernvergrößerung und zytoplasmatischer Kondensation in Synzytien, die vom Typ II-Pneumozyten stammen. Das Zytoplasma der vielkernigen, dichten und vakuolären Zellen bestätigt, dass die Synzytialzellen ihren Ursprung in Pneumozyten vom Typ II haben. Diese Zellen zeigten eine mäßige Immunfluoreszenz mit SARS-CoV-2-Spike-Protein-spezifischen Antikörpern, was auf das Vorhandensein des Virus hinweist. Die REM-Bildgebung zeigte eine Oberflächenmorphologie mit kleinen Mikrovilli, ein charakteristisches Merkmal von Pneumozyten-Typ-II-Zellen (Abb. 1). Wir konnten unter TEM keine solchen Synzytien finden, die ein besseres Verständnis der ultrastrukturellen Veränderungen nach der Synzytienbildung hätten ermöglichen können.

Synzytialzellen, die aus der homotypischen Fusion von Typ-II-Pneumozyten von COVID-19-Patienten im mittelschweren Stadium der Erkrankung (zwischen 9 und 16 Tagen nach den ersten Symptomen) entstehen. (A) Das Zytoplasma der vielkernigen, dichten, kernhaltigen und vakuolären Zellen bestätigt die Typ-II-Pneumozyten in der PAP-Bildgebung. (B) Die vollständige Membranfusion von Typ-II-Pneumozyten (zwei) mit mäßiger Immunfluoreszenz unter Verwendung eines SARS-CoV-2-Spike-Protein-spezifischen Primärantikörpers weist auf das Vorhandensein des Virus hin. (C) Das SEM-Bild (Oberflächenultrastruktur) von Typ-II-Pneumozyten zeigte eine kleine mikrovilliartige Struktur, die für Typ-II-Pneumozyten charakteristisch ist. N, Kern; weißer Pfeil, SARS-CoV-2-Virus; Oranger Pfeil, Mikrovilli.

Wir haben auch Synzytialzellen neutrophilen Ursprungs unter PAP, IF, SEM und TEM in einem mittelschweren Krankheitszustand beobachtet. Die PAP-Bildgebung identifizierte die synzytiale Bildung von zwei Neutrophilen mit mehreren Kernen (nicht mehrlappigen Kernen) (Abb. 2A). Immunfluoreszenzstudien bestätigen die schwere zelluläre Infektion und das Vorhandensein des SARS-CoV-2-Virus. Die mehrkernigen Zellen mit typischen Neutrophilensignaturen bestätigen ihre Herkunft (Abb. 2B). Die REM-Bildgebung ergab eine Synzytialzelle von ~ 40 μm mit dem charakteristischen Merkmal (raue Oberfläche mit Membranvorsprung) neutrophilen Ursprungs (Abb. 2C). Die TEM-Bildgebung zeigte den Beginn der Plasmamembranfusion mit zwei benachbarten Neutrophilen (Abb. 2D). Diese Startpunkte der Membranfusionen waren bei höherer Vergrößerung deutlich sichtbar, was ein wesentlicher erster Schritt für die Bildung synzytialer Zellen nach einer Virusinfektion sein könnte (Abb. 2E-F). Im Zytoplasma dieser Zellen wurden mehrere unreife und reife Viruspartikel beobachtet (Pfeile).

Synzytialzellen neutrophilen Ursprungs zeigten den Beginn der Plasmamembranfusion. (A) PAP-Bildgebung von Synzytien mit dichtem Kern und körnigem Zytoplasma, die den Ursprung der Neutrophilen bestätigen. (B) Synzytialzelle neutrophilen Ursprungs mit mehreren Kernen und Immunfluoreszenz, die eine SARS-CoV-2-Infektion bestätigt. C. SEM-Bild einer Synzytialzelle neutrophilen Ursprungs mit einer Größe von 40 μm. Die raue Oberfläche mit Plasmamembranvorsprüngen mit zahlreichen virusähnlichen Partikeln (weißer Pfeil) bestätigte den Ursprung der Neutrophilen. (D, E & F) TEM-Bilder mit niedriger und hoher Vergrößerung, die den Beginn der Synzytienbildung (Membranfusion) zeigen. N, Kern; M, Mitochondrien; P, Phagosomen; RB, Restkörper; B, Bakterien; Pse, Pseudopodien; weißer Pfeil, SARS-CoV-2-Virus; schwarze Pfeilspitze, die Stelle der Membranverschmelzung.

In den moderaten Stadien der Erkrankung wurden mehrere heterotypische Synzytien aus der Neutrophilen-Monozyten-Fusion beobachtet. Diese Zellen wurden in der PAP-, IF- und TEM-Bildgebung beobachtet. Die IF-Bildgebung bestätigt die Bildung synzytialer Zellen mit Neutrophilen und Monozyten bei mittelschwerer bis schwerer SARS-CoV-2-Infektion (Abb. 3B-C). TEM zeigte den Beginn der Plasmamembranfusion mit benachbarten Zellen (schwarze Pfeilspitzen) an mehreren Stellen. Die monozytischen Ursprungszellen (mittlere Zellen) zeigten charakteristische ultrastrukturelle Merkmale wie einen zweilappigen Kern, das Vorhandensein eines Lipidkörpers und phagozytischer Körnchen (Abb. 3D-G). Zu den Ultrastrukturmerkmalen gehören zahlreiche primäre azurophile (große und elektronendichte), sekundäre spezifische Granula (kleine, leichte Färbung), Pseudopodien in der Plasmamembran, stark gefaltete Zellmembranen und eine große Anzahl von Phagozyten der benachbarten Zellen zu Monozyten, die diese bestätigen als neutrophile Granulozyten. Diese Zellen zeigten eine relativ höhere Anzahl ausgereifter Viren im Zytoplasma (weißer Pfeil).

Synzytialzellen, die aus Zellen verschiedener Herkunft von COVID-19-induzierten ARDS-Patienten gebildet werden. (A) PAP-Bildgebung von Monozyten und Neutrophilen mit mehrlappigem und hufeisenförmigem Kern. (B) Mehrlappige Kerne und zentrisches Nuklein bestätigen, dass die Neutrophilen- bzw. Monozytenzellen einen moderaten Grad an SARS-CoV-2-Infektion in IF aufweisen. (CF) Membranfusion zwischen Monozyten und zwei benachbarten Neutrophilen unter TEM-Bildgebung mit unterschiedlichen Vergrößerungen. Monozyten wurden aufgrund des Vorhandenseins aktiver Lipidkörper und eines zentralen Zellkerns identifiziert. Die neutrophilen Granula und Phagozyten bestätigen den neutrophilen Ursprung der benachbarten Zellen. N, Kern; M, Mitochondrien; RB, Restkörper; L, Lipidkörper; weißer Pfeil, SARS-CoV-2-Virus; schwarze Pfeilspitze, die Fusionsstelle der Plasmamembran.

Im BALF von leicht und mittelschwer infizierten Patienten wurden keine ausgereiften Synzytialzellen beobachtet. Allerdings wurden in der REM-Bildgebung bei den schweren ARDS-ähnlichen Patienten große Synzytialzellen (bis zu 100 μm) mit ovaler Morphologie beobachtet. Die ultrastrukturelle Oberflächenmorphologie weist auf Neutrophile (Abb. 4A), Monozyten (Abb. 4B) und Makrophagenursprung (Abb. 4C) hin. Das Vorhandensein von Pseudopodien in der Plasmamembran und der stark gefalteten Zellmembran bestätigt den neutrophilen Ursprung (Abb. 4A). Andere ausgereifte Synzytialzellen monozytischen Ursprungs wurden durch ihre glatte Oberfläche und das Vorhandensein vieler bakterienähnlicher Strukturen identifiziert, was auf phagozytische Zellen hinweist (Abb. 4B). Die Oberflächenmorphologie wie zytoplasmatische Vorsprünge und Wellenstruktur ähneln denen des Makrophagen (Abb. 4C). Eine solche Art ausgereifter Synzytien wurde im TEM nicht beobachtet.

Reife Synzytialzellen unter REM-Bildgebung. Synzytialzellen wurden durch die Fusion mehrerer Zellen (A) neutrophilen Ursprungs (bestätigt durch Oberflächenprojektion), (B) Monozyten (identifiziert durch glatte Oberfläche) und (C) Makrophagenursprungs (zytoplasmatische Projektion) erzeugt. ARDS-ähnliche COVID-19-Patienten Bei Patienten mit schwerem ARDS-ähnlichem Krankheitsverlauf wurden reife Synzytialzellen beobachtet, jedoch nicht im leichten oder mittelschweren Stadium der Erkrankung. Weißer Pfeil, SARS-CoV-2-Virus; B, Bakterien (orangefarbener Pfeil).

Die COVID-19-Krankheit, die durch die schwere Infektion mit dem akuten respiratorischen Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht wird, ist zu einer großen Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit geworden [28, 29]. Bei vielen Patienten bleiben die Symptome mild (nur Infektionen der oberen Atemwege mit leichtem Fieber und ohne Atemnot oder Hypoxie, SpO2 > 95 %) und klingen durch symptomorientierte Medikamente automatisch innerhalb von vier bis sieben Tagen ab. Einige Patienten, die primäre ARDS-ähnliche Erkrankungen entwickelten, benötigen einen Krankenhausaufenthalt mit mittlerem Schweregrad (Atemfrequenz ≥ 24/min, Atemlosigkeit und SpO2-Wert 90 % bis ≤ 93 % bei Raumluft). Eine maximale Anzahl von Patienten zeigte zwischen 8 und 15 Tagen nach den ersten Symptomen mittelschwere krankheitsähnliche Symptome. Allerdings entwickelten 2–5 % der COVID-19-Patienten schwere ARDS-ähnliche Erkrankungen mit häufigen Atemproblemen, niedrigem SpO2 (< 90 %) und hohen CT-Werten (> 16) [30, 31]. Eine höhere Anzahl an Patienten wurde nach dem 17. Krankheitstag gemeldet. Die Bildung von Synzytien ist mit der Schwere von COVID-19 verbunden. Es ist jedoch möglich, dass die Bildung von Synzytien auch mit der Dauer der Infektion sowie anderen Faktoren wie der Immunantwort des Patienten und der Viruslast zusammenhängt. Es ist immer noch nicht vollständig geklärt, welchen Einfluss die Bildung von Synzytien auf die Pathogenese von COVID-19 hat. Daher haben wir beide Parameter wie den Schweregrad der Erkrankung und den Tag der Probenentnahme nach der Infektion herangezogen, um den Zustand des Patienten anzugleichen.

Die histologische Bildgebung von Lungenautopsieproben (Tod durch COVID-19) zeigte mehrkernige Riesen-Syncytialzellen [12, 15, 16, 20]. Es ist jedoch schwierig, anhand dieser Autopsieproben den Beginn der Synzytienbildung und ihren Zusammenhang mit dem Krankheitsstadium zu untersuchen. Dies liegt daran, dass histologische Techniken auf Lichtmikroskopie nicht geeignet sind, die respiratorischen und hämatopoetischen Zellen zu identifizieren, die an der Bildung von Synzytien beteiligt sind. Unsere auf Elektronenmikroskopie basierende Ultrastrukturstudie von BALF-Proben von leicht infizierten COVID-19-Patienten fand keine Synzytien (Zusatzdatei 1. Abbildung S1). Dies weist darauf hin, dass SARS-CoV-2-Viren im Anfangsstadium der Erkrankung möglicherweise keine Membranfusion einleiten. Dies kann daran liegen, dass das Virus dazu neigt, sich zu vermehren, tropisch zu sein und in der Anfangsphase der Krankheit die maximale Anzahl an Zellen, die sich vermehren können, einschließlich des Mund- und Atemwegsepithels, infiziert [32, 33]. In diesem Stadium benötigt das Virus keine besondere Unterstützung für seine Replikation, Verbreitung, Immunumgehung und Entzündungsreaktionen, da die immunologische Reaktion des Wirts noch nicht effizient aktiviert wurde. Im moderaten Stadium der Erkrankung wurde jedoch ein negativer Druck auf die Replikation und Verbreitung des SARS-CoV-2-Virus durch die Aktivierung humoraler und zellulärer immunologischer Reaktionen erzeugt [34]. Die Aktivierung von Makrophagen und die Infiltration von Granulozyten im Lungengewebe (Neutropenie) zwingen das Virus dazu, seinen Schutzmechanismus zu aktivieren, um seine Replikation und Verbreitung durch die Verschmelzung der Plasmamembran von Atmungs- und hämopoetischen Zellen zu erleichtern [20, 35, 36]. Dies könnte ein Grund für die Fusion der Plasmamembran mit identischen und heterotypischen Zellen im moderaten Stadium der Erkrankung sein (Abb. 1, 2 und 3). In diesem Krankheitsstadium wurden vollständig fusionierte zweikernige Pneumozyten-Syncytialzellen vom Typ II beobachtet (Abb. 1). Allerdings wurde in einem ähnlichen Krankheitsstadium eine unvollständige Plasmamembranfusion (Einleitung der Membranfusion) in Zellen hämopoetischen Ursprungs wie Monozyten und Neutrophilen beobachtet (Abb. 2 und 3). Dies weist darauf hin, dass Pneumozyten vom Typ II die erste Wahl des Virus waren, um die Bildung synzytialer Zellen zu induzieren, was bei der Replikation und dem Schutz des Virus vor der Immunantwort hilfreich sein könnte [21]. Dies könnte der Grund für die hohe Fluoreszenz (ein Hinweis auf eine starke Infektion und Vermehrung) in Synzytialzellen vom Typ II sein, die aus Pneumozyten stammen (Abb. 1). Dies stützte auch eine aktuelle Studie, die entscheidende Erkenntnisse und die Folgen der Bildung mehrkerniger Riesenzellen nach SARS-CoV-2-Infektionen lieferte [16, 20]. Darüber hinaus wurde auch über die Bildung homologer Synzytien in vitro in Vero-Zellen (ACE2+) berichtet, die das SARS-CoV-2-Spike-Protein exprimieren [21].

Es wird vermutet, dass Synzytien auch zur Virusverbreitung und Immunumgehung beitragen können, indem sie das Virus vor Immunzellen und neutralisierenden Antikörpern schützen [1, 12]. In unserer Studie deutet der Beginn einer identischen (bei Neutrophilen) und heterotypischen Zellfusion (mit Neutrophilen und Monozyten) im moderaten Stadium der Erkrankung auf die Hyperaktivierung viraler Fusogenproteine hin, um die Synzytienbildung in diesen hämatopoetischen Zellen einzuleiten (Abb. 2 und 2). 3). Es wurde berichtet, dass das virale Spike (S)-Protein als Fusogen auf der Oberfläche einer infizierten Zelle wirkte, das mit Rezeptoren benachbarter Zellen interagierte, um Synzytialzellen zu bilden [37]. Neben seiner Fähigkeit, die Fusion viraler und zellulärer Membranen voranzutreiben, kann das S-Protein auch die Fusion benachbarter Zellen vorantreiben, was zur Bildung mehrkerniger Riesenzellen führt [12, 14, 15]. Dieser Befund wurde auch durch eine kürzlich durchgeführte Studie gestützt, in der SARS-CoV-2-induzierte Synzytien auf die Lymphozyten abzielten, um sie zu internalisieren und durch Zelle in Zelle zu eliminieren, was möglicherweise zur Lymphopenie und Pathogenese bei COVID-19-Patienten beiträgt [20].

Der Nachweis reifer und sehr großer Synzytialzellen (20–100 μm) von Neutrophilen und Monozyten, die in sehr späten und schweren Stadien (ARDS-ähnlich) der Erkrankung entstanden sind, deutete auf die Rolle von Synzytialzellen bei der Verbreitung des Virus und der Immunumgehung hin. Diese riesigen Synzytialzellen können bei der Vermehrung und beim Schutz vor der Immunantwort des Körpers helfen, was möglicherweise der Grund für die Aktivierung von Alveolarmakrophagen und letztlich für den Zytokinsturm ist [20]. Reife Synzytialzellen wurden in unserer TEM-Bildgebung nicht identifiziert, obwohl dies in den Autopsieproben berichtet wurde. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass weniger solcher Zellarten aus dem infizierten Lungengewebe in den BALF der Patienten freigesetzt werden.

Die Bildung von Synzytien ist ein wichtiger Schritt zum Schutz und zur Unterstützung der Vermehrung des SARS-CoV-2-Virus nach einer effizienten immunologischen Aktivierung von Patienten. Die aktuelle Studie zeigte, dass die Bildung von Synzytien zunächst bei Typ-II-Pneumozyten durch homotypische Fusion und später bei hämatopoetischen Zellen (Monozyten und Neutrophilen) durch heterotypische Fusion im moderaten Stadium (9–16 Tage) der Erkrankung induziert wurde. Die Synzytien reiften in der Spätphase der Erkrankung und bildeten große Riesenzellen von 20 bis 100 μm. Diese detaillierte ultrastrukturelle Studie über einzelne und unterschiedliche Zellursprünge von Synzytien könnte den Grad untersuchen, in dem Synzytialzellen zur Pathologie beitragen, und Einblicke in die Krankheitsbiologie von COVID-19 geben.

Die Anzahl der Bioproben und die Patientendetails sind in der Zusatzdatei 1: Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

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Wir danken allen Angehörigen der Patienten für die Erlaubnis, BALF von den Patienten abzuholen. SAIF-AIIMS New Delhi wird für die Bildgebungseinrichtung für SEM und TEM gedankt. Die konfokale Mikroskopanlage DST-FIST wird auch für Immunfluoreszenzstudien anerkannt. Wir danken ICMR, SERB und AIIMS Intramural für die Finanzierung.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des IUSSTF Indo-US Virtual Network für das COVID-19-Programm (IUSSTF/VN-COVID/007/2020) und das DBT-SAHAJ-Programm (BT/INF/22/SP44285/2021) unterstützt.

Elektronenmikroskopische Einrichtung, Abteilung für Anatomie, All India Institute of Medical Sciences, Neu-Delhi, Delhi, 110029, Indien

Shikha Chaudhary, Ravi P. Yadav und Subhash Chandra Yadav

Abteilung für Anästhesiologie, Schmerzmedizin und Intensivpflege, All India Institute of Medical Sciences, Neu-Delhi, Delhi, 110029, Indien

Shailendra Kumar

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SC führte die Experimente zur Probenverarbeitung, zur Standardisierung der PAP- und IF-Bildgebung, zur Elektronenmikroskopie, zur Interpretation der Daten, zur Verwaltung klinischer Aufzeichnungen und zur Erstellung von Mikroskopiedaten durch. SK hat die Probe auf den Intensivstationen gesammelt. SK war an der Gestaltung der Studie und der Standardisierung der Probenentnahmestrategien beteiligt. RPY half bei der Manuskriptvorbereitung und beim Experimentieren. SCY entwarf die Studie, führte und überwachte Experimente mit COVID-19-Patienten, analysierte die Daten, generierte die Zahlen, verfasste das Manuskript und leitete das Projekt. Alle Autoren haben den endgültigen Entwurf dieses Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Subhash Chandra Yadav.

Für die aktuelle Studie wurde eine ethische Genehmigung des Institutional Ethics Committee (IEC) des All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) New Delhi, Indien (Ref. Nr. IEC-307/27.04.2020, RP-10/202) eingeholt. Für die BALF-Probenentnahme bei SARS-CoV-2-infizierten und intubierten Patienten wurde die schriftliche Zustimmung aller Patientenvertreter eingeholt.

Alle Autoren haben dieses Manuskript zur Veröffentlichung freigegeben. Konkurrierende Interessen sind nicht anwendbar.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chaudhary, S., Yadav, RP, Kumar, S. et al. Ultrastrukturelle Studie bestätigt die Bildung einzelner und heterotypischer Synzytialzellen in bronchoalveolären Flüssigkeiten von COVID-19-Patienten. Virol J 20, 97 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02062-7

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Eingegangen: 23. November 2022

Angenommen: 02. Mai 2023

Veröffentlicht: 19. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02062-7

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